КИНЕТИКА ВОССТАНОВЛЕНИЯ ТРИФЕНИЛТЕТРАЗОЛИЯ ХЛОРИДА СУСПЕНЗИРОВАННЫМИ В ФИЗИОЛОГИЧЕСКОМ РАСТВОРЕ БАКТЕРИЯМИ
КИНЕТИКА ВОССТАНОВЛЕНИЯ ТРИФЕНИЛТЕТРАЗОЛИЯ ХЛОРИДА СУСПЕНЗИРОВАННЫМИ В ФИЗИОЛОГИЧЕСКОМ РАСТВОРЕ БАКТЕРИЯМИ
Гурский Николай Васильевич
аспирант, ФГБОУ ВО «Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева»,
РФ, г. Н. Новгород
Калинина Александра Александровна
канд. хим. наук, доц., ФГБОУ ВО «Нижегородский государственный
технический университет им. Р.Е. Алексеева»,
РФ, г. Н. Новгород
Кортюкова Наталья Евгеньевна
магистрант, ФГБОУ ВО «Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева»,
РФ, г. Н. Новгород
Соколова Татьяна Николаевна
д-р хим. наук, проф., ФГБОУ ВО «Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева»,
РФ, г. Н. Новгород
АННОТАЦИЯ
Изучена зависимость скорости накопления трифенилформазана при восстановлении трифенилтетразолия хлорида бактериями Bacillus stearothermophilus и Staphylococcus xylosus, суспензированными в физиологическом растворе. Показана на количественном уровне низкая способность трифенилтетразолия хлорида к восстановлению, определен характер кинетической кривой накопления продукта восстановления.
Ключевые слова: кинетика, скорость восстановления, трифенилтетразолия хлорид, трифенилмоноформазан.
Через интенсивность восстановления солей тетразолия оценивается жизнеспособность микроорганизмов и их сообществ при мониторинге экологического состояния почвы, воды, в гистохимических исследованиях отдельных тканей, в решении других вопросов с участием биологических объектов.
Часто для этих целей используется коммерчески доступный трифенилтетразолия хлорид (ТТХ). В частности, на основе этой соли тетразолия разработана широко применяемая в практических целях мультисубстратная тест-система «Эколог» [1-2]. Вместе с тем количественные характеристики по скорости восстановления ТТХ различными клетками в настоящее время отсутствуют. Ранее с использованием йоднитротетразолия хлорида (ИНТ) было показано, что для изучения системы соль тетразолия – суспензированные в физиологическом растворе бактерии могут быть использованы методы и математический аппарат формальной химической кинетики [3,4].
Целью настоящей работы явилось кинетическое исследование восстановление ТТХ, как наиболее используемого неселективного индикатора жизнеспособности клеток, клеточными компонентами бактерий, суспензированных в физиологическом растворе. В качестве объектов исследования на основании скрининга бактерий, были выбраны грамположительные бактерии Bacillus stearothermophilus и Staphylococcus xylosus предоставленные коллекцией Всероссийской коллекцией микроорганизмов (г. Пущино, Московская обл.).
Методика кинетического эксперимента. Рабочие растворы тетразолиевых солей с концентрацией 1,0 мМ готовились в физиологическом растворе (0,9% водный раствор хлорида натрия), которые до использования в эксперименте хранились в темноте не более 3 недель.
Выращенную на скошенном мясопептонном агаре (МПА) суточную культуру смывали физиологическим раствором и доводили до оптической плотности 0,10±0,05 (670 нм), что обеспечивало в пределах ошибки одинаковое количество клеток в единице объема физиологического раствора. После чего к аликвоте полученной бактериальной суспензии в стерильных условиях добавляли рассчитанное количество раствора ТТХ до необходимой (начальной) концентрации и выдерживали в термостате при температуре эксперимента. По истечении определенного времени в условиях слабой освещенности для предотвращения окисления формазанов, 5 мл суспензии отбирали в пробирку, содержащую 0,1 мл раствора лизоцима (С = 0,2 мг/л). Спустя 30 с смесь экстрагировали этилацетатом. При необходимости к экстракту добавляли 0,1 мл 10%-ого раствора гидроксида натрия. По прошествию 20 с в реакционную смесь добавляли свежепрокаленный хлорид кальция и выдерживали в течение 1 мин, после чего экстракт отфильтровывали и анализировали спектрофотометрически в кюветах толщиной 1 см при соответствующих длинах волн, характерных для продуктов восстановления используемых солей тетразолия. Коэффициент экстинкции определяли экспериментально по линейной зависимости оптической плотности от концентрации формазанов при длине волны 484 нм, характерной для трифенилформазана. Полученное значение, равное 1,7·104л·моль-1·см-1, согласуются с литературными данными.
Скорость реакции определяли спектрофотометрически по накоплению продукта трифенилформазана (ТФ).
Реакция протекает по известной реакции [5]:
Здесь D – донор электронов биогенной природы в восстановленной (Dred) и окисленной (Dox) формах соответственно.
На рисунках 1 и 2 представлены кинетические кривые накопления ТФ при участии бактерий Bacillus stearothermophilus и Staphylococcus xylosus соответственно.
|
|
|
|
Рисунок 1. Кинетическая кривая накопления трифенилформазана под воздействием Bacillus stearothermophilus (t = 37°C [ТТХ]0 = 8,82·10-5 М) |
Рисунок 2. Кинетическая кривая накопления трифенилформазана под воздействием Staphylococcus xylosus (t = 37°C [ТТХ]0 = 8,82·10-5 М) |
Как видно из представленных данных, на кинетических кривых можно выделить достаточно продолжительный период индукции. Ранее при изучении восстановления ИНТ такого явления не наблюдалось [3,4]. При увеличении времени экспозиции кинетические кривые выходят на плато, после чего динамика в накоплении ТФ прекращалась, причем конверсия реагента при выходе на плато в случае бактерий Staphylococcus xylosus не превышает 6 %.
Таким образом, ТТХ обладает низкой способностью к восстановлению, которая зависит от формы в ряду грамположительных бактерий. Сферические кокки, обладающие меньшей поверхностью контакта с реагентом, затрудняют транспорт ТТХ к сайтам восстановления. С другой стороны, продукт восстановления ТФ в виду малой полярности обладает высоким сродством к белковым компонентам бактерий, что приводит к блокированию активных восстановительных центров и замедлению реакции, что проявляется с появлением на кинетической кривой области плато.
Список литературы:
- Способ мультисубстратного тестирования микробных сообществ и его применение: пат. 2335543 Рос. Федерация: МПК C12Q1/02 / Горленко М.В., Кожевин П.А., Терехов А.С.; заявитель и патентообладатель ООО «Экологический центр «Эко-терра». – № 2006124312/13; заявл. 07.07.06.
- Горленко М.В. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ / Горленко М.В., Кожевин П.А. – М.: МАКС Пресс, 2005.
- Калинина А.А., Македошин А.С., Радостин С.Ю., Гурский Н.Ю., Соколова Т.Н., Карташов В.Р. // Вестник Московского университета. Серия 2 Химия. 2019. Т. 60. № 1. С. 27 – 34.
- Калинина А.А., Македошин А.С., Гурский Н.В., Соколова Т.Н., Смирнов В.Ф. // Теоретическая и прикладная экология. 2018. № 1. С. 25-32.
- Seidler E. The Tetrazolium-Fonnazan System: Design and Histochemistry / E. Seidler – ISBN 3-437-11366-6. New York: G.Fischer. Stuttgart, 1991. 79 p.